Inżynieria enzymów sprzężona ze wzrostem poprzez manipulację regeneracją kofaktora redoks

Obecnie coraz szersza gama chemikaliów jest produkowana z surowców odnawialnych za pomocą środków biotechnologicznych. Bioprocesy w dużym stopniu opierają się na katalizie enzymatycznej w celu wydajnej produkcji tych związków. Zapewnienie, że enzymy działają optymalnie w wymaganym środowisku, ma zatem duże znaczenie dla zrównoważonej produkcji.

Właściwości takie jak specyficzność substratu, szybkość katalityczna i (termo)stabilność należą do kilku krytycznych czynników, które należy zoptymalizować pod kątem wydajnych bioprocesów napędzanych enzymami. Ta optymalizacja może być czasochłonna, kosztowna i wymagająca, a zatem skuteczne i opłacalne sposoby selekcji sprzężonej ze wzrostem, enzymy inżynieryjne o pożądanych właściwościach są bardzo poszukiwane.

Zalety stosowania selekcji sprzężonej ze wzrostem jako formy selekcji enzymów, która polega na powiązaniu aktywności enzymu ze wzrostem komórki. Metoda ta może być stosowana jako wysokowydajna strategia selekcji i może być osiągnięta poprzez zapewnienie, że wzrost zależy od syntezy produktu przez enzym docelowy lub poprzez powiązanie aktywności enzymu z globalnym stanem energetycznym komórki. Biologia syntetyczna może być wykorzystana do inżynierii szczepów odpowiednich do selekcji sprzężonej ze wzrostem, a ostatnie postępy koncentrują się na szczepach inżynieryjnych z niedoborem utlenionych lub zredukowanych stanów par kofaktorów redoks, które mogą służyć jako platformy inżynierii enzymów. Wykorzystanie tych platform może przyspieszyć rozwój ulepszonych biokatalizatorów i bioprocesów.

Korzyści ze sprzężenia wzrostu poprzez auksotrofię kofaktora

Korzyści ze stosowania auksotrofii kofaktorowej jako metody selekcji enzymów inżynieryjnych zaangażowanych w biosyntezę niektórych substancji chemicznych, takich jak lipidy, biopaliwa, gazy, rozpuszczalniki organiczne lub związki polimerowe. Takie podejście oferuje kilka unikalnych korzyści, w tym możliwość wyboru pożądanego produktu niezależnie od substratu lub produktu, co ułatwia wykrycie ulepszonej aktywności enzymatycznej i oferuje odczyt w celu wykrycia ulepszonej aktywności enzymatycznej. Ponadto wykorzystanie auksotrofów kofaktorów jako platform sprzęgających wzrost jest korzystne, ponieważ wszechobecny charakter kofaktorów redoks w metabolizmie drobnoustrojów oznacza, że strategie inżynieryjne mogą być przenoszone z boku na inne interesujące drobnoustroje, a enzymy mogą być bezpośrednio modyfikowane w środowisku pożądanego gospodarza mikrobiologicznego. (pokazano na rysunku 1)

Rysunek 1: Porównanie kilku szeroko stosowanych technik badań przesiewowych/selekcji w inżynierii enzymów

Mutanty z niedoborem utleniania NADH

Utlenianie NADH w E. coli może nastąpić na dwie drogi, w zależności od dostępności tlenu. W warunkach tlenowych NADH jest utleniany głównie przez oddychanie w celu wytworzenia ATP, podczas gdy w warunkach beztlenowych może być utleniany przez szlaki fermentacji w celu wytworzenia mleczanu i etanolu. Zmutowane szczepy E. coli, niezdolne do wykorzystania mieszanych szlaków fermentacji do utleniania NADH podczas wzrostu beztlenowego, zostały wykorzystane do napędzania szlaków utleniających NADH do beztlenowej syntezy różnych substancji chemicznych, takich jak 2-metylopropan-1-ol, 2,3-butanodiol, 1-butanol i L-alanina. Te zmutowane szczepy zostały również wykorzystane do inżynierii enzymów poprzez wykorzystanie podobnych zasad redoks, co spowodowało ulepszone warianty. Otrzymane szczepy można wykorzystać do inżynierii innych enzymów i szlaków zależnych od NAD (P) H.

Mutanty z niedoborem redukcji NAD+

Wenk i in. stworzyli szczep E. coli, usuwając gen dehydrogenazy dihydrolipoylowej (lpd), co spowodowało, że szczep nie był w stanie wygenerować mocy redukującej (NADH i NADPH) z metabolizmu octanu z powodu braku aktywności dehydrogenazy pirogronianowej. Spowodowało to, że szczep wykazywał auksotrofię w celu zmniejszenia mocy, gdy był uprawiany tlenowo na octanie jako jedynym źródle węgla. (pokazano na rysunku 2) Szczep był w stanie rosnąć na octanie po uzupełnieniu górnymi substratami glikolitycznymi lub podczas ekspresji zależnych od NAD + dehydrogenaz mrówczanu, etanolu lub metanolu z ich odpowiednimi substratami. Szczep nie był wykorzystywany do inżynierii enzymatycznej i był oceniany tylko pod kątem auksotrofii kofaktora redoks.
 

Rycina 2: Metabolizm centralny

Mutanty z niedoborem utleniania NADPH

Istnieją dwie różne strategie indukowania auksotrofii NADP + u E. coli, polegające na inżynierii szlaku glikolitycznego w celu nadprodukcji NADPH. Pierwsza strategia polega na usunięciu natywnego genu gapA i ekspresji heterologicznego enzymu GAPDH zależnego od NADP +, podczas gdy druga strategia polega na przekierowaniu strumienia węgla przez szlak pentozofosforanowy. Powstałe szczepy nie są w stanie rosnąć na glukozie, ale wykazują wzrost w różnych warunkach, przy czym pierwszy szczep rośnie w warunkach beztlenowych, a drugi w warunkach tlenowych z glicerolem jako substratem. Szczepy te są wykorzystywane do inżynierii enzymów o ulepszonych właściwościach, w tym specyficzności substratu, aktywności katalitycznej i termostabilności.

Mutanty z niedoborem redukcji NADP+

Trzy różne bakterie, E. coli, P. putida i C. glutamicum, zostały zaprojektowane tak, aby były NADPH-auksotroficzne, co oznacza, że wymagają egzogennego NADPH do wzrostu. W przypadku E. coli i C. glutamicum centralne enzymy metaboliczne zostały wyeliminowane, aby uniknąć redukcji NADP +, gdy glukoza została dostarczona jako źródło węgla, podczas gdy w P. putida inżynieria wspomagana CRISPR / nCas9 została wykorzystana do sekwencyjnego zakłócenia zestawów genów docelowych, aby zrozumieć ich udział w metabolizmie redoks. Szczepy NADPH-auksotroficzne wykorzystano następnie do inżynierii enzymów sprzężonych ze wzrostem w oparciu o specyficzność kofaktora. Pojedyncza runda mutagenezy z wykorzystaniem E. coli dała najbardziej wydajną i specyficzną dehydrogenazę mrówczanu zależną od NADP +, podczas gdy P. putida i C. glutamicum reprezentują pierwsze szczepy swojego gatunku, które można wykorzystać do tego typu inżynierii.

Mutanty z niedoborem redukcji NMN+

Opracowano system selekcji sprzężony ze wzrostem, aby połączyć cykl kofaktora i wzrost w oparciu o niedobór redukcji NMN+. Zastosowano szczep E. coli SHuffle, który przenosi delecje w dwóch genach zaangażowanych w produkcję zredukowanego glutationu. Reduktaza glutationowa zależna od NMNH została opracowana poprzez racjonalną mutagenezę, aby połączyć proces z cyklami NMN + / NMNH, a dehydrogenaza glukozy zależna od NMN + została wykorzystana do wspierania cyklu kofaktora NMN + / NMNH, a tym samym wzrostu. W badaniu zastosowano również po raz pierwszy niekanoniczną auksotrofię kofaktora redoks do inżynierii enzymów sprzężonych ze wzrostem, co dało termostabilny wariant dehydrogenazy fosforynowej o poprawionej wydajności katalitycznej i stabilności czasowej in vitro. Praca dostarcza użytecznego szczepu do inżynierii enzymów sprzężonych ze wzrostem, zależnej od cyklu NMN+/NMNH i auksotroficznej dla zredukowanego stanu niekanonicznego kofaktora redoks.

 

Potencjał sprzęgania wzrostu za pomocą kofaktorów redoks działał jako potężne narzędzie do inżynierii biokatalizatorów, szczególnie w kontekście zrównoważonej bioprodukcji. Chociaż poczyniono znaczne postępy w generowaniu redoks kofaktorów auksotroficznych, oświadczenie sugeruje, że nadal istnieje kilka niezbadanych dróg badań. Jeden z nich obejmuje inżynierię kofaktorów auksotroficznych szczepów organizmów innych niż E. coli, co może otworzyć nowe możliwości inżynierii enzymów sprzężonych ze wzrostem.

Ogólnie rzecz biorąc, sugeruje to, że zastosowanie sprzężenia wzrostu opartego na kofaktorach redoks stanowi główną szansę dla inżynierii biokatalizy, szczególnie w przypadku wytwarzania produktów, które nie mogą spełnić wymagań innych wysokowydajnych podejść do inżynierii enzymów. Podkreślono w nim potrzebę opracowania bardziej wszechstronnych i wydajnych biokatalizatorów dla zrównoważonej bioprodukcji i podkreślono znaczenie kontynuowania badań w tej dziedzinie.


Źródło: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Growth-coupled enzyme engineering through manipulation of redox cofactor regeneration, Biotechnology Advances, 2023.