Optymalizacja warunków reakcji w celu uzyskania wysokiej wydajności stewii rebaudiozydu D
Diety o wysokiej zawartości cukru doprowadziły do rosnącej częstości występowania różnych chorób przewlekłych, w tym otyłości, cukrzycy, chorób sercowo-naczyniowych i nadciśnienia, co stanowi poważny globalny problem zdrowia publicznego. Stevia Rebaudioside D (Reb D), naturalny słodzik pochodzący z roślin, zyskał znaczną uwagę jako substytut cukru ze względu na zerową zawartość kalorii, intensywną słodycz i przyjemny profil smakowy.
Jednak jego ograniczona obecność w stewii rebaudiana Bertoni i wyzwania związane z niską rozpuszczalnością i aktywnością enzymatyczną glikozylotransferazy pochodzenia roślinnego utrudniły jej szerokie zastosowanie komercyjne. W odpowiedzi na te problemy odkryto nową glikozylotransferazę o nazwie YojK, pochodzącą z Bacillus subtilis 168. Badanie to wprowadza genetycznie zmodyfikowaną glikozylotransferazę bakteryjną, YojK-I241T/G327N, charakteryzującą się wysoką rozpuszczalnością i wydajnością katalityczną, oferującą duży potencjał do produkcji Reb D na skalę przemysłową.
Opracowanie wysoce wydajnej metody wytwarzania rebaudiozydu D z wykorzystaniem reakcji kaskadowej enzymów YojK-I241T/G327N i AtSuSy.
Aby rozwiązać problem niskiej rozpuszczalności w glikozylotransferazach pochodzenia roślinnego, naukowcy zbadali potencjał wykorzystania YojK, O-glikozylotransferazy z Bacillus subtilis 168. YojK został wybrany ze względu na wykazaną aktywność glikozylacyjną z różnymi substratami, w tym dużymi cząsteczkami. Po udanej rekombinowanej ekspresji i oczyszczeniu, YojK został wykorzystany do glikozylanu Reb A, co spowodowało produkcję stewii Reb D. Analiza kinetyczna enzymu wykazała, że YojK ma niższą aktywność katalityczną w kierunku Reb D w porównaniu z innymi glikozylotransferazami. W związku z tym badanie sugeruje konieczność inżynierii sterowanej strukturą w celu zwiększenia aktywności katalitycznej YojK dla potencjalnych zastosowań praktycznych. (jak pokazano na rysunku 1)
Ryc. 1
Optymalizacja warunków reakcji w celu uzyskania wysokiej wydajności rebaudiozydu D.
Warunki reakcji, w tym pH, temperaturę i stężenie substratu, można zoptymalizować w celu uzyskania wysokiej wydajności produktu Srevia Reb D. W badaniu wykorzystano symulacje dynamiki molekularnej do zbadania, w jaki sposób wariant YojK-I241T / G327N zwiększa glikozylację Reb D. Wariant utrzymywał stabilne wiązanie wodorowe między Reb A i H14 podczas symulacji, w przeciwieństwie do typu dzikiego (jak pokazano na rysunku 2). Ta stabilność rozciągała się również na odległość między atomem O2 Reb A a C1P UDPG. Ulepszona wydajność katalityczna wariantu YojK-I241T/G327N została przypisana tym stabilnym interakcjom, co sugeruje jego praktyczny potencjał.
Ryc. 2
Rysunek 3
Konkluzja
Takie podejście dało 83,47% Reb D. Warto zauważyć, że dodanie 1 mM UDPG pozwoliło na syntezę 20,59 g / L Reb D z niezwykłą wydajnością 91,29%, przewyższającą wcześniejsze badania. Proces ten pokazuje potencjał produkcji Reb D na skalę przemysłową, zwłaszcza po inżynierii budowlanej YojK.YojK może być skutecznie wyrażany w E. coli BL21 (DE3) z wysoką rozpuszczalnością. Dzięki inżynierii sterowanej strukturą stworzono podwójny mutant, YojK-I241T / G327N, umożliwiający produkcję Reb D na dużą skalę z wyjątkową wydajnością 91,29% poprzez recykling UDPG katalizowany przez syntazę sacharozy AtSuSy. Niniejsze opracowanie przedstawia YojK-I241T/G327N jako obiecujące narzędzie do ekonomicznie efektywnej produkcji Reb D na skalę przemysłową.
