Kwantyfikacja NAD + i jego metabolitów w nerwach kulszowych myszy

Wprowadzenie

Kluczowe części dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD+) i jego metabolitów w starzeniu się i neurodegeneracji zostały powszechnie poznane. Aby pobudzić postęp w kierunku badań biochemicznych i interwencji ukierunkowanych na starzenie się i choroby neurodegeneracyjne, ogromne znaczenie ma dokładne określenie ilościowe poziomów NAD + i jego metabolitów w szlaku ratunkowym NAD +. W tym przypadku stosuje się solidną i dokładną metodę LC-MS / MS do ilościowego określenia poziomów NAD + i jego metabolitów w normalnym i uszkodzonym nerwie kulszowym myszy.

Ograniczenia istniejących metod ilościowego oznaczania NAD+ i jego metabolitów

Tradycyjne metody ilościowego oznaczania NAD+ i jego metabolitów, takie jak HPLC-UV, NMR, elektroforeza w strefie kapilarnej lub kolorymetryczne testy enzymatyczne, stoją przed różnymi wyzwaniami w zakresie czułości, selektywności i pomiarów pośrednich. Jeśli chodzi o istniejące testy LC-MS / MS dla komórkowych lub tkankowych pomiarów NAD+ i jego metabolitów, nadal istnieje wiele trudności do pokonania, takich jak wydłużony czas pracy, słabe zachowanie retencji chromatograficznej i niezadowalające kształty pików. Co więcej, tylko jedna do trzech substancji na ścieżce ratowania NAD+ może być pokryta tymi metodami.

Modyfikacje metody LC-MS/MS

Na podstawie istniejących testów LC-MS/MS przeprowadza się modyfikacje dotyczące warunków chromatograficznych, matrycy zastępczej i warunków MS/MS. W szczególności 5 μM kwasu metylenofosfonowego jest stosowane jako dodatek do fazy ruchomej, który wyraźnie promuje intensywność sygnału i kształt piku. Biorąc pod uwagę stosunkowo czystą i prostą naturę próbek nigdy nie będących próbkami oraz ich niewielkie rozmiary, woda ultraczysta jest testowana jako matryca zastępcza. Zamiast kolumny do chromatografii cieczowej z oddziaływaniami hydrofilowymi i kolumny hiperwęglowodanowej, stosuje się kolumnę Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, której unikalna technologia powierzchni o wysokiej wydajności MaxPeak HPS (pasywacja wewnętrznej ścianki kolumny, eliminacja powierzchni metalowej) umożliwia wysoką odtwarzalność, symetrię pików i separację linii podstawowej wszystkich analitów.Poza tym warunki MS są zoptymalizowane w celu zminimalizowania sygnału interferencyjnego NAD + w kanale cyklicznej rybozy adenozynodifosforanu (cADPR) przy jednoczesnym zachowaniu odpowiedzi cADPR i mononukleotydu nikotynamidu (NMN), przy napięciu rozpylania jonów 4000 °C, 450 °C dla temperatury turbopodgrzewacza, 50 psi dla gazu 1, 50 psi dla gazu 2, 30 psi dla gazu kurtynowego i 12 psi dla gazu zderzeniowego.

Reprezentatywny chromatogram próbek nerwów (prawidłowy i uszkodzony)

Wszystkie pięć analitów osiąga separację wyjściową, gdzie cADPR jest wrażliwym biomarkerem w modelu neurodegeneracji. W tym przypadku aksotomia nerwu kulszowego indukuje zwyrodnienie aksonów, prowadząc do obniżonego poziomu NAD + i podwyższonego poziomu NMN w uszkodzonych nerwach, co powoduje około 2-krotny wzrost stosunku NMN / NAD +. Jednocześnie poziom nikotynamidu (NAM) i rybozy adenozynodifosforanu (ADPR) jest obniżony około 2-krotnie, podczas gdy poziom cADPR wzrasta ponad 8-krotnie. Wyniki te są zgodne z wynikami wcześniej zgłoszonych badań, weryfikujących dokładność tej zmodyfikowanej metody LS-MS/MS w ilościowym określaniu NAD+ i jego metabolitów.

Konkluzja

Ta zmodyfikowana metoda LC-MS/MS umożliwia skuteczną separację linii bazowej NAD+, NMN, NAM, ADPR i cADPR w krótkim czasie działania wynoszącym 5 minut, co przyczynia się do wczesnej diagnozy różnych zaburzeń neurologicznych i opracowywania leków na starzenie się i choroby neurodegeneracyjne.

Odniesienie

Ma Y, Deng L, Du Z. Opracowanie i walidacja metody LC-MS / MS do ilościowego oznaczania NAD + i pokrewnych metabolitów w nerwach kulszowych myszy i jej zastosowanie do modelu zwierzęcego uszkodzenia nerwów. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821

BONTAC NAD

BONTAC (BONTAC) od 2012 roku zajmuje się badaniami i rozwojem, produkcją i sprzedażą surowców do koenzymu i produktów naturalnych, z własnymi fabrykami, ponad 170 globalnymi patentami, a także silnym zespołem badawczo-rozwojowym. BONTAC posiada bogate doświadczenie badawczo-rozwojowe i zaawansowaną technologię w zakresie biosyntezy NAD i jego prekursorzy (np. NMN i NR). Do wyboru są różne rodzaje NAD, w tym NAD ER Grade (usuwanie endotoksyn), NAD Grade I (IVD / suplement diety / surowy proszek kosmetyczny), NAD Grade II (API / półprodukty) i NAD Grade IV (jeśli istnieje wyższe wymagania dotyczące rozpuszczalności), które mogą być dostarczane w postaci liofilizowanego proszku lub krystalicznego proszku. Czystość BONTAC NAD może sięgać ponad 98%.

Zrzeczenie się

Ten artykuł jest oparty na odnośniku w czasopiśmie naukowym. Odpowiednie informacje są udostępniane wyłącznie w celach informacyjnych i edukacyjnych i nie stanowią żadnych celów porad medycznych. W przypadku naruszenia praw autorskich prosimy o kontakt z autorem w celu ich usunięcia. Poglądy wyrażone w tym artykule nie reprezentują stanowiska BONTAC. W żadnym wypadku BONTAC nie ponosi żadnej odpowiedzialności za jakiekolwiek roszczenia, szkody, straty, wydatki lub koszty wynikające lub wynikające bezpośrednio lub pośrednio z polegania na informacjach i materiałach zawartych na tej stronie internetowej.