Ilościowa identyfikacja NAD+ i jego metabolitów w nerwach kulszowych myszy
Wprowadzenie
Kluczowe składniki nikotynamidu-adenindydowego (NAD+) oraz jego metabolitów w starzeniu się i neurodegeneracji zostały szeroko docenione. Aby pobudzić postępy w badaniach biochemicznych i interwencjach ukierunkowanych na starzenie się i choroby neurodegeneracyjne, niezwykle istotne jest dokładne ilościowe określenie NAD+ i jego metabolitów na szlaku ratowania NAD+. Stosuje się tu solidną i dokładną metodę LC-MS/MS, aby ilościowo określić poziomy NAD+ i jego metabolitów w prawidłowym i uszkodzonym nerwie kulszowym myszy.Ograniczenia istniejących metod ilościowego określania NAD+ i jego metabolitów
Tradycyjne metody ilościowego określania NAD+ i jego metabolitów, takie jak HPLC-UV, NMR, elektroforeza strefy kapilarnej czy kolorymetryczne testy enzymatyczne, napotykają różne wyzwania w zakresie czułości, selektywności i pomiaru pośredniego. Jeśli chodzi o istniejące testy LC-MS/MS dla pomiarów komórkowego lub tkankowego NAD+ oraz jego metabolitów, wciąż istnieje wiele trudności do pokonania, takich jak wydłużone czasy pracy, słabe zachowanie retencji chromatograficznej oraz niezadowalający kształt szczytów. Ponadto tylko jedna do trzech substancji w szlaku ratowania NAD+ mogą być objęte tymi metodami.Modyfikacje metody LC-MS/MS
Na podstawie istniejących testów LC-MS/MS przeprowadzane są modyfikacje dotyczące warunków chromatograficznych, macierzy zastępczej oraz warunków MS/MS. Konkretnie, 5 μM kwasu fosfonowego metylenu jest stosowane jako dodatek fazy ruchomej, który wyraźnie zwiększa intensywność sygnału i kształt piku. Biorąc pod uwagę stosunkowo czysty i prosty charakter próbek nigdy oraz ich niewielkie rozmiary, ultraczysta woda jest testowana jako matryca zastępcza. Zamiast kolumny chromatografii ciekłej z interakcji hydrofilowej i kolumny hiperwęglowodanowej, stosuje się kolumnę Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, której unikalna wysokowydajna technologia powierzchniowa MaxPeak HPS (pasywacja wewnętrznej ściany kolumny, eliminacja powierzchni metalu) umożliwia wysoką powtarzalność, symetrię szczytów i rozdzielanie bazowe wszystkich analitów. Ponadto warunki MS są zoptymalizowane tak, aby zminimalizować sygnał zakłócenia NAD+ w cyklicznym kanale rybozy adenozynodyfosforanu (cADPR), przy jednoczesnym zachowaniu odpowiedzi cADPR i mononukleotydu nikotynamidu (NMN), z napięciem natrysku jonowym 4000V, temperaturą turbogrzewacza 450°C, gazem 1 50 psi, gazem 2 50 psi, gazem zasłonowym 30 psi oraz gazem kolizyjnym 12 psi.
Reprezentatywny chromatogram próbek nerwowych (prawidłowe vs uszkodzone)
Wszystkie pięć analitów osiąga separację bazową, gdzie cADPR jest czułym biomarkerem w modelu neurodegeneracji. W tym przypadku aksotomia nerwu kulszowego wywołuje zwyrodnienie aksonów, prowadząc do obniżenia poziomu NAD+ i podwyższenia poziomu NMN w uszkodzonych nerwach, co skutkuje około dwukrotnym wzrostem stosunku NMN/NAD+. Równocześnie poziomy nikotynamidu (NAM) i rybozy adenozynodifosforanu (ADPR) spadły około dwukrotnie, podczas gdy poziom cADPR wzrósł ponad 8-krotnie. Wyniki te są zgodne z wcześniej opublikowanymi badaniami, które potwierdzają dokładność tej zmodyfikowanej metody LS-MS/MS w ilościowym określaniu NAD+ i jego metabolitów.
Podsumowanie
Ta zmodyfikowana metoda LC-MS/MS umożliwia skuteczne podstawowe rozdzielenie NAD+, NMN, NAM, ADPR i cADPR w krótkim czasie działania 5 minut, co przyczynia się do wczesnej diagnozy różnych zaburzeń neurologicznych oraz rozwoju leków na starzenie się i choroby neurodegeneracyjne.Bibliografia
Ma Y, Deng L, Du Z. Opracowanie i walidacja metody LC-MS/MS do ilościowego określania metabolitów NAD+ i powiązanych metabolitów u nerwów kulszowych myszy oraz jej zastosowanie w modelu zwierzęcym z uszkodzeniem nerwu. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACod 2012 roku jest zaangażowana w badania i rozwój, produkcję oraz sprzedaż surowców do koenzymów i produktów naturalnych, posiadając własne fabryki, ponad 170 globalnych patentów oraz silny zespół badawczo-rozwojowy. BONTAC posiada bogate doświadczenie w badaniach i rozwoju oraz zaawansowaną technologię w biosyntezieNAD i jego poprzednicy(np. NMN i NR). Do wyboru należy wybrać różne typy NAD, w tym NAD ER (usuwanie endoksyny), NAD Grade I (IVD/suplementy diety/surowy proszek kosmetyczny), NAD Grade II (API/pośredniki) oraz NAD Grade IV (jeśli występują wyższe wymagania dotyczące rozpuszczalności), które mogą być dostarczone w formie liofilizowanego proszku lub proszku krystalicznego. Czystość BONTAC NAD może przekraczać 98%.
