Ilościowe oznaczanie NAD+ i jego metabolitów w nerwach kulszowych myszy
Wprowadzenie
Kluczowe znaczenie dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NAD+) i jego metabolitów w starzeniu się i neurodegeneracji jest powszechnie uznawane. Aby przyspieszyć postęp w badaniach biochemicznych i interwencjach ukierunkowanych na starzenie się i choroby neurodegeneracyjne, niezwykle istotne jest dokładne ilościowe oznaczenie poziomów NAD+ i jego metabolitów w szlaku ratunkowym NAD+. W niniejszej pracy zastosowano solidną i dokładną metodę LC-MS/MS do ilościowego oznaczania poziomów NAD+ i jego metabolitów w prawidłowym i uszkodzonym nerwie kulszowym myszy.Ograniczenia istniejących metod ilościowego oznaczania NAD+ i jego metabolitów
Tradycyjne metody ilościowego oznaczania NAD+ i jego metabolitów, takie jak HPLC-UV, NMR, kapilarna elektroforeza strefowa czy kolorymetryczne testy enzymatyczne, napotykają różne wyzwania w zakresie czułości, selektywności i pomiaru pośredniego. Jeśli chodzi o istniejące testy LC-MS/MS do pomiarów komórkowych lub tkankowych NAD+ i jego metabolitów, wciąż istnieje wiele trudności do pokonania, takich jak długi czas analizy, słabe właściwości retencji chromatograficznej i niezadowalające kształty pików. Ponadto metody te mogą obejmować tylko jedną do trzech substancji w szlaku ratunkowym NAD+.Modyfikacje metody LC-MS/MS
Na podstawie istniejących testów LC-MS/MS przeprowadzono modyfikacje dotyczące warunków chromatograficznych, matrycy zastępczej i warunków MS/MS. W szczególności 5 μM kwasu metylenofosfonowego zastosowano jako dodatek do fazy ruchomej, co wyraźnie poprawia intensywność sygnału i kształt piku. Ze względu na stosunkowo czysty i prosty charakter próbek nerwów oraz ich mały rozmiar, przetestowano ultraczystą wodę jako matrycę zastępczą. Zamiast kolumny chromatografii hydrofilowej oddziaływań (HILIC) i kolumny hypercarb zastosowano kolumnę Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, której unikalna technologia powierzchniowa MaxPeak HPS (pasywacja wewnętrznej ściany kolumny, eliminacja powierzchni metalowej) umożliwia wysoką powtarzalność, symetrię pików i rozdział podstawowy wszystkich analitów.Ponadto zoptymalizowano warunki MS, aby zminimalizować sygnał interferencyjny NAD+ w kanale cyklicznej adenozynodifosforanorybozy (cADPR), zachowując jednocześnie odpowiedź cADPR i mononukleotydu nikotynoamidowego (NMN), przy napięciu jonizacji 4000 V, temperaturze turbogrzewacza 450℃, ciśnieniu gazu 1 wynoszącym 50 psi, ciśnieniu gazu 2 wynoszącym 50 psi, ciśnieniu gazu zasłonowego wynoszącym 30 psi i ciśnieniu gazu kolizyjnego wynoszącym 12 psi.
Reprezentatywny chromatogram próbek nerwów (prawidłowe vs uszkodzone)
Wszystkie pięć analitów osiąga rozdział podstawowy, gdzie cADPR jest czułym biomarkerem w modelu neurodegeneracji. W niniejszym badaniu aksotomia nerwu kulszowego indukuje degenerację aksonów, prowadząc do obniżonego poziomu NAD+ i podwyższonego poziomu NMN w uszkodzonych nerwach, co skutkuje około 2-krotnym wzrostem stosunku NMN/NAD+. Jednocześnie poziomy nikotynamidu (NAM) i adenozynodifosforanorybozy (ADPR) zmniejszają się około 2-krotnie, podczas gdy poziom cADPR wzrasta ponad 8-krotnie. Wyniki te są zgodne z wynikami wcześniej opublikowanych badań, potwierdzając dokładność tej zmodyfikowanej metody LC-MS/MS w ilościowym oznaczaniu NAD+ i jego metabolitów.
Podsumowanie
Ta zmodyfikowana metoda LC-MS/MS umożliwia skuteczny rozdział podstawowy NAD+, NMN, NAM, ADPR i cADPR w krótkim czasie analizy wynoszącym 5 minut, co przyczynia się do wczesnej diagnozy różnych zaburzeń neurologicznych oraz rozwoju leków na starzenie się i choroby neurodegeneracyjne.Bibliografia
Ma Y, Deng L, Du Z. Opracowanie i walidacja metody LC-MS/MS do ilościowego oznaczania NAD+ i pokrewnych metabolitów w nerwach kulszowych myszy oraz jej zastosowanie w zwierzęcym modelu uszkodzenia nerwu. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACod 2012 roku zajmuje się badaniami i rozwojem, produkcją oraz sprzedażą surowców do koenzymów i produktów naturalnych, posiadając własne fabryki, ponad 170 globalnych patentów oraz silny zespół badawczo-rozwojowy. BONTAC ma bogate doświadczenie badawczo-rozwojowe i zaawansowaną technologię w biosyntezieNAD i jego prekursorów(np. NMN i NR). Dostępne są różne rodzaje NAD do wyboru, obejmujące NAD ER Grade (usuwanie endotoksyn), NAD Grade I (proszek surowy do IVD/suplementów diety/kosmetyków), NAD Grade II (API/półprodukty) oraz NAD Grade IV (jeśli istnieją wyższe wymagania dotyczące rozpuszczalności), które mogą być dostarczane w postaci liofilizowanego proszku lub proszku krystalicznego. Czystość NAD firmy BONTAC może osiągnąć ponad 98%.
