Inżynieria enzymów sprzężonych wzrostem poprzez manipulację regeneracją kofaktora redoks

Coraz szerszy zakres chemikaliów jest obecnie produkowany z odnawialnych surowców za pomocą środków biotechnologicznych. Bioprocesy w dużej mierze opierają się na katalizie enzymatycznej do efektywnej produkcji tych związków. Dlatego zapewnienie optymalnej wydajności enzymów w wymaganym środowisku jest bardzo istotne dla zrównoważonej produkcji.

Właściwości takie jak specyficzność podłoża, szybkość katalityczna i (termo)stabilność to jedne z kilku kluczowych czynników, które muszą być zoptymalizowane dla efektywnych procesów enzymatycznych. Ta optymalizacja może być czasochłonna, kosztowna i wymagająca, dlatego skuteczne i opłacalne sposoby prawdopodobnie do selekcji sprzężonej ze wzrostem; inżynieria enzymów o pożądanych cechach jest bardzo poszukiwana.

Zalety stosowania selekcji sprzężonej wzrostem jako formy selekcji enzymów, która polega na powiązaniu aktywności enzymu z wzrostem komórki. Metoda ta może być stosowana jako strategia selekcji o wysokiej przepustowości i można ją osiągnąć poprzez zapewnienie, że wzrost zależy od syntezy produktu przez docelowy enzym, albo poprzez powiązanie aktywności enzymu z globalnym stanem energetycznym komórki. Biologia syntetyczna może być wykorzystywana do inżynierii szczepów odpowiednich do selekcji sprzężonej wzrostem, a ostatnie osiągnięcia koncentrują się na inżynierii szczepów niedobornych w stanach utlenienia lub redukcji par kofaktorów redoks, które mogą służyć jako platformy inżynierii enzymów. Wykorzystanie tych platform może przyspieszyć rozwój ulepszonych biokatalizatorów i procesów.

Korzyści ze sprzężenia wzrostu za pomocą auxotrofii kofaktora

Korzyści płynące z wykorzystania auxotrofii kofaktora jako metody selekcji do inżynierii enzymów zaangażowanych w biosyntezę niektórych chemikaliów, takich jak lipidy, biopaliwa, gazy, rozpuszczalniki organiczne czy związki polimerowe. To podejście oferuje kilka unikalnych korzyści, w tym możliwość wyboru pożądanego produktu niezależnie od substratu lub interesującego produktu, co ułatwia wykrywanie poprawy aktywności enzymatycznej oraz oferuje odczyt do wykrywania poprawy aktywności enzymatycznej. Dodatkowo, wykorzystanie auxotrofów kofaktorów jako platform do sprzężenia wzrostu jest korzystne, ponieważ wszechobecny charakter koczynników redoks w metabolizmie mikroorganizmów sprawia, że strategie inżynieryjne mogą być lateralnie przenoszone na inne interesujące mikroorganizmy, a enzymy mogą być bezpośrednio inżynierowane w środowisku pożądanego gospodarza mikroorganizmów. (pokazano na rysunku 1)

Rysunek 1: Porównanie kilku szeroko stosowanych technik przesiewania/selekcji w inżynierii enzymów

Mutanty niedoborowe w zakresie utleniania NADH

Utlenianie NADH w E. coli może zachodzić dwoma drogami, w zależności od dostępności tlenu. W warunkach tlenowych NADH jest głównie utleniany przez oddychanie, aby wytwarzać ATP, natomiast w warunkach beztlenowych może być utleniany przez szlaki fermentacyjne, tworząc mleczan i etanol. Zmutowane szczepy E. coli, które nie potrafią wykorzystywać mieszanych szlaków fermentacji do utleniania NADH podczas wzrostu beztlenowego, były wykorzystywane do napędzania szlaków utleniających NADH do beztlenowej syntezy różnych chemikaliów, takich jak 2-metylopropan-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol i L-alanina. Te zmutowane szczepy były również wykorzystywane do inżynierii enzymów poprzez wykorzystanie podobnych zasad redoks, co skutkowało ulepszonymi wariantami. Powstałe szczepy mogą być wykorzystywane do inżynierii innych enzymów i szlaków zależnych od NAD(P)H.

Mutanci z niedoborem redukcji NAD+  

Wenk i in. stworzyli szczep E. coli poprzez usunięcie genu dehydrolipoyldehydrogenazy (LPD), co spowodowało, że szczep nie był w stanie generować mocy redukującej (NADH i NADPH) z metabolizmu octanowych z powodu braku aktywności dehydrogenazy piruwianowej. Powodowało to, że szczep wykazywał auxotrofię dla zmniejszenia mocy podczas uprawy aerobnej na octacie jako jedynym źródle węgla. (pokazano na rysunku 2) Szczep mógł rosnąć na octacie po uzupełnieniu o podłoża o wyższej glikolizie lub przy ekspresji dehydrogenaz NAD+-zależnych od formatu, etanolu lub metanolu w ich odpowiednich substratach. Szczep ten nie był używany do inżynierii enzymów i oceniano jedynie pod kątem auxotrofii kofaktora redoks.
 

Rysunek 2: Metabolizm centralny 

Mutanty niedoborowe w zakresie utleniania NADPH

Istnieją dwie różne strategie indukowania auxotrofii NADP+ u E. coli, polegające na inżynierii szlaku glikolitycznego do nadprodukcji NADPH. Pierwsza strategia polega na usunięciu natywnego genu gapA i ekspresji heterologicznego enzymu GAPDH zależnego od NADP+, podczas gdy druga polega na przekierowaniu strumienia węgla przez szlak fosforanu pentozowego. Powstałe szczepy nie mogą rosnąć na glukozie, ale wykazują wzrost w różnych warunkach, przy czym pierwszy szczep rośnie w warunkach beztlenowych, a drugi w warunkach tlenowych z glicerolem jako podłożem. Te szczepy są wykorzystywane do inżynierii enzymów o ulepszonych właściwościach, w tym specyficzności podłoża, aktywności katalitycznej i termostabilności.

Mutanci niedoborowi redukcji NADP+

Trzy różne bakterie: E. coli, P. putida i C. glutamicum, zostały zaprojektowane tak, aby były NADPH-auxotroficzne, co oznacza, że do wzrostu wymagają egzogenicznego NADPH. W przypadku E. coli i C. glutamicum centralne enzymy metaboliczne zostały wyeliminowane, aby uniknąć redukcji NADP+, gdy glukoza była dostarczana jako źródło węgla, natomiast u P. putida zastosowano inżynierię wspomaganą CRISPR/nCas9 do sekwencyjnego zakłócania zestawów genów docelowych w celu zrozumienia ich udziału w metabolizmie redoks. Szczepy NADPH-auxotroficzne zostały następnie wykorzystane do inżynierii enzymów sprzężonych wzrostem opartej na specyficzności kofaktorowej. Pojedyncza runda mutagenezy z użyciem E. coli dała do tej pory najwydajniejszą i najbardziej specyficzną dehydrogenazę formatową zależną od NADP+, podczas gdy P. putida i C. glutamicum stanowią pierwsze szczepy swojego gatunku, które można wykorzystać do tego typu inżynierii.

Mutanci niedoborowi redukcji NMN+

Opracowano system selekcji sprzężonej wzrostem, który łączy cykl kofaktorów ze wzrostem na podstawie niedoboru redukcji NMN+. Zastosowano szczep E. coli SHuffle, który zawiera delecje w dwóch genach zaangażowanych w produkcję zredukowanego glutationu. Poprzez racjonalną mutagenezę opracowano reduktazę glutationową zależną od NMNH, aby powiązać proces z cyklem NMN+/NMNH, a do wsparcia cyklu kofaktora NMN+/NMNH zastosowano dehydrogenazę zależną od NMN+/NMNH, aby wspierać cykl kofaktorów NMN+/NMNH. Badanie zastosowało również niekanoniczną auxotrofię kofaktora redoksowego do inżynierii enzymów sprzężonych wzrostem po raz pierwszy, co skutkowało termostabilnym wariantem dehydrogenazy fosfitowej o poprawionej wydajności katalitycznej i stabilności czasowej in vitro. Prace stanowią użyteczny szczep dla inżynierii enzymów sprzężonych wzrostem, zależną od cyklu NMN+/NMNH oraz auxotroficzną dla zredukowanego stanu niekanonicznego kofaktora redoks.

Potencjał sprzężenia wzrostu za pomocą koczynników redoks okazał się potężnym narzędziem do inżynierii biokatalizatorów, szczególnie w kontekście zrównoważonej bioprodukcji. Chociaż poczyniono znaczne postępy w generowaniu szczepów auxotrofowych kofaktora redoks, oświadczenie sugeruje, że wciąż istnieje kilka nieodkrytych dróg badawczych. Jednym z nich jest inżynieria współczynników auxotrofowych organizmów innych niż E. coli, co może otworzyć nowe możliwości dla inżynierii enzymów sprzężonych wzrostowo.

Ogólnie sugeruje to, że zastosowanie sprzężenia wzrostu opartego na kofaktorze redoks stanowi ogromną szansę na inżynierię biokatalizy, szczególnie do produkcji produktów, które nie są w stanie spełnić wymagań innych wysokoprzepustowych podejść do inżynierii enzymów. Podkreśla potrzebę opracowania bardziej wszechstronnych i wydajnych biokatalizatorów dla zrównoważonej bioprodukcji oraz podkreśla znaczenie dalszych badań w tym obszarze.


Źródło: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Inżynieria enzymów sprzężonych wzrostem poprzez manipulację regeneracją kofaktorów redoks, Biotechnology Advances, 2023.