Optymalizacja warunków reakcji w celu osiągnięcia wysokiej wydajności stevia rebaudioside d
Diety bogate w cukr doprowadziły do wzrostu występowania różnych chorób przewlekłych, w tym otyłości, cukrzycy, chorób sercowo-naczyniowych i nadciśnienia, co stanowi poważne globalne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Stevia Rebaudioside D (Reb D), naturalny słodzik pozyskiwany z roślin, zyskał dużą uwagę jako substytut cukru ze względu na swoją bezkaloryczną zawartość, intensywną słodycz i przyjemny profil smakowy.
Jednak jej ograniczona obecność u stevia rebaudiana Bertoni oraz wyzwania związane z niską rozpuszczalnością i aktywnością enzymatyczną glikozylotransferazy pochodzenia roślinnego utrudniły jej szerokie zastosowanie komercyjne. W odpowiedzi na te problemy odkryto nową glikozylotransferazę zwaną YojK, pochodzącą z Bacillus subtilis 168. Badanie wprowadza genetycznie modyfikowaną bakteryjną glikozylotransferazę, YojK-I241T/G327N, charakteryzującą się wysoką rozpuszczalnością i efektywnością katalityczną, oferującą duży potencjał produkcji Reb D na skalę przemysłową.
Opracowanie wysoce efektywnej metody produkcji rebaudiozydu D z wykorzystaniem reakcji kaskadowej enzymów YojK-I241T/G327N oraz AtSuSy.
Aby rozwiązać problem niskiej rozpuszczalności w glikozylotransferazach pochodzenia roślinnego, badacze badali potencjał wykorzystania YojK, O-glikozylotransferazy z Bacillus subtilis 168. YojK został wybrany ze względu na wykazaną aktywność glikozylacji przy użyciu różnych substratów, w tym dużych cząsteczek. Po pomyślnej ekspresji rekombinowanej i oczyszczaniu, YojK został użyty do glikozylacji Reb A, co doprowadziło do produkcji Stevia Reb D. Analiza kinetyczna enzymów wykazała, że YojK wykazuje niższą aktywność katalityczną wobec Reb D w porównaniu z innymi glikozylotransferazami. W konsekwencji badanie sugeruje konieczność inżynierii sterowanej strukturą, aby zwiększyć aktywność katalityczną YojK dla potencjalnych praktycznych zastosowań. (jak pokazano na Rysunku 1)
Rysunek 1
Optymalizacja warunków reakcji w celu uzyskania wysokiej wydajności rebaudiosydu D.
Warunki reakcji, w tym pH, temperatura i stężenie substratu, mogą być optymalizowane, aby uzyskać wysoką wydajność Srevia Reb D. Badanie wykorzystało symulacje dynamiki molekularnej do zbadania, jak wariant YojK-I241T/G327N zwiększa glikozylację Reb D. Wariant ten utrzymywał stabilne wiązanie wodorowe między Reb A a H14 podczas symulacji, w przeciwieństwie do typu dzikiego (jak pokazano na Rysunku 2). Ta stabilność rozciągała się także na odległość między atomem O2 Reb A a C1P UDPG. Poprawioną wydajność katalityczną wariantu YojK-I241T/G327N przypisano tym stabilnym interakcjom, co sugeruje jego praktyczny potencjał.
Rysunek 2
Rysunek 3
Podsumowanie
To podejście dało 83,47% Reb D. Co istotne, dodanie 1 mM UDPG pozwoliło na syntezę 20,59 g/L Reb D z imponującym plonowaniem 91,29%, przewyższając wcześniejsze badania. Proces ten pokazuje potencjał produkcji Reb D na skalę przemysłową, zwłaszcza po inżynierii konstrukcyjnej YojK.YojK może być efektywnie wyrażany w E. coli BL21 (DE3) o wysokiej rozpuszczalności. Dzięki inżynierii sterowanej strukturą stworzono podwójnego mutanta, YojK-I241T/G327N, umożliwiającego masową produkcję Reb D o wyjątkowej wydajności 91,29% poprzez recykling UDPG katalizowanego przez syntazę sacharozy AtSuSy. Niniejsze badanie przedstawia YojK-I241T/G327N jako obiecujące narzędzie do efektywnej produkcji przemysłowej Reb D na skalę ekonomiczną.
